Mga produkto

Ang pag-unawa sa metabolismo ng microbial host ay mahalaga para sa pagbuo at pag-optimize ng buong-cell based na biocatalytic na proseso, dahil ito ay nagdidikta ng kahusayan sa produksyon.Ito ay totoo lalo na para sa redox biocatalysis kung saan ang metabolically active cells ay ginagamit dahil sa cofactor/cosubstrate regenerative capacity na endogenous sa host.Ang Recombinant Escherichia coli ay ginamit para sa labis na paggawa ng proline-4-hydroxylase (P4H), isang dioxygenase na nag-catalyze ng hydroxylation ng libreng L-proline sa trans-4-hydroxy-L-proline na may a-ketoglutarate (a-KG) bilang cosubstrate.Sa buong-cell na biocatalyst na ito, ang central carbon metabolism ay nagbibigay ng kinakailangang cosubstrate na a-KG, na direktang pinagsama ang P4H biocatalytic na pagganap sa carbon metabolism at metabolic na aktibidad.Sa pamamagitan ng paglalapat ng parehong pang-eksperimentong at computational na mga tool sa biology, tulad ng metabolic engineering at (13) C-metabolic flux analysis ((13) C-MFA), sinisiyasat namin at inilarawan sa dami ang physiological, metabolic, at bioenergetic na tugon ng buong-cell biocatalyst sa target na bioconversion at natukoy ang mga posibleng metabolic bottleneck para sa karagdagang rational pathway engineering. Ang isang proline degradation-deficient E. coli strain ay binuo sa pamamagitan ng pagtanggal sa putA gene encoding proline dehydrogenase.Ang buong-cell na biotransformations na may ganitong mutant strain ay humantong hindi lamang sa quantitative proline hydroxylation kundi pati na rin sa pagdodoble ng tiyak na trans-4-L-hydroxyproline (hyp) formation rate, kumpara sa wild type.Ang pagsusuri ng carbon flux sa pamamagitan ng central metabolism ng mutant strain ay nagsiwalat na ang tumaas na demand ng a-KG para sa aktibidad ng P4H ay hindi nagpahusay sa a-KG generating flux, na nagpapahiwatig ng isang mahigpit na kinokontrol na operasyon ng TCA cycle sa ilalim ng mga kondisyong pinag-aralan.Sa wild type strain, ang P4H synthesis at catalysis ay nagdulot ng pagbawas sa biomass yield.Kapansin-pansin, binabayaran din ng ΔputA strain ang nauugnay na pagkawala ng ATP at NADH sa pamamagitan ng pagbabawas ng mga pangangailangan sa enerhiya sa pagpapanatili sa mabababang rate ng pag-uptake ng glucose, sa halip na pataasin ang aktibidad ng TCA. Ang putA knockout sa recombinant E. coli BL21(DE3)(pLysS) ay natagpuan na maging promising para sa produktibong P4H catalysis hindi lamang sa mga tuntunin ng biotransformation yield, kundi pati na rin tungkol sa mga rate para sa biotransformation at proline uptake at ang yield ng hyp sa pinagmumulan ng enerhiya.Ang mga resulta ay nagpapahiwatig na, sa isang putA knockout, ang pagkabit ng TCA-cycle sa proline hydroxylation sa pamamagitan ng cosubstrate a-KG ay nagiging isang pangunahing kadahilanan na pumipigil at isang target upang higit pang mapabuti ang kahusayan ng mga biotransformations na umaasa sa a-KG.