balita

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ay isang analogue ng β-galactosidase substrate, na kung saan ay lubos na inducible.Sa ilalim ng induction ng IPTG, ang inducer ay maaaring bumuo ng isang kumplikadong may repressor protein , Upang ang conformation ng repressor protein ay mabago, upang hindi ito maisama sa target na gene, at ang target na gene ay ipinahayag nang mahusay.Kaya paano dapat matukoy ang konsentrasyon ng IPTG sa panahon ng eksperimento?Mas maganda ba ang mas malaki?
Una, unawain natin ang prinsipyo ng IPTG induction: Ang lactose operon (elemento) ng E. coli ay naglalaman ng tatlong structural genes, Z,Y, at A, na naka-encode ng β-galactosidase, permease, at acetyltransferase, ayon sa pagkakabanggit.Ang lacZ ay nag-hydrolyze ng lactose sa glucose at galactose, o sa allo-lactose;Ang lacY ay nagpapahintulot sa lactose sa kapaligiran na dumaan sa lamad ng cell at pumasok sa selula;Inililipat ng lacA ang pangkat ng acetyl mula sa acetyl-CoA patungo sa β-galactoside, na kinabibilangan ng pag-alis ng Toxic effect.Bilang karagdagan, mayroong isang operating sequence O, isang panimulang sequence P at isang regulatory gene I. Ang I gene code ay isang repressor protein na maaaring magbigkis sa posisyon O ng operator sequence, upang ang operon (meta) ay repressed at Naka-off.Mayroon ding binding site para sa catabolic gene activator protein-CAP binding site upstream ng initiating sequence P. Ang P sequence, O sequence at CAP binding site na magkasama ay bumubuo ng regulatory region ng lac operon.Ang coding genes ng tatlong enzymes ay kinokontrol ng parehong rehiyon ng regulasyon upang makamit ang coordinated expression ng mga produkto ng gene.

Sa kawalan ng lactose, ang lac operon (meta) ay nasa estado ng panunupil.Sa oras na ito, ang lac repressor na ipinahayag ng I sequence sa ilalim ng kontrol ng PI promoter sequence ay nagbubuklod sa O sequence, na pumipigil sa RNA polymerase mula sa pagbubuklod sa P sequence at pinipigilan ang pagsisimula ng transkripsyon;kapag ang lactose ay naroroon, ang lac operon (meta) ay maaaring ma-induce Sa operon (meta) system na ito, ang tunay na inducer ay hindi lactose mismo.Ang lactose ay pumapasok sa cell at na-catalyzed ng β-galactosidase upang ma-convert sa allolactose.Ang huli, bilang isang inducer molecule, ay nagbubuklod sa repressor protein at binabago ang protein conformation, na humahantong sa dissociation ng repressor protein mula sa O sequence at transcription.Ang Isopropylthiogalactoside (IPTG) ay may parehong epekto tulad ng allolactose.Ito ay isang napakalakas na inducer, na hindi na-metabolize ng bacteria at napakatatag, kaya malawak itong ginagamit sa mga laboratoryo.

Paano matukoy ang pinakamainam na konsentrasyon ng IPTG?Kunin ang E. coli bilang isang halimbawa.
Ang E. coli BL21 genetically engineered strain na naglalaman ng positibong recombinant pGEX (CGRP/msCT) ay inoculated sa LB liquid medium na naglalaman ng 50μg·mL-1 Amp, at na-culture magdamag sa 37°C.Ang kultura sa itaas ay inoculated sa 10 bote ng 50mL fresh LB liquid medium na naglalaman ng 50μg·mL-1 Amp sa ratio na 1:100 para sa expansion culture, at kapag ang OD600 value ay 0.6~0.8, IPTG ay idinagdag sa panghuling konsentrasyon.Ito ay 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Pagkatapos ng induction sa parehong temperatura at sa parehong oras, 1 mL ng bacterial solution ay kinuha mula dito, at ang mga bacterial cell ay nakolekta sa pamamagitan ng centrifugation at sumailalim sa SDS-PAGE upang pag-aralan ang impluwensya ng iba't ibang mga konsentrasyon ng IPTG sa pagpapahayag ng protina, at pagkatapos piliin ang konsentrasyon ng IPTG na may pinakamalaking expression ng protina.
Pagkatapos ng mga eksperimento, makikita na ang konsentrasyon ng IPTG ay hindi kasing laki hangga't maaari.Ito ay dahil ang IPTG ay may tiyak na toxicity sa bacteria.Ang paglampas sa konsentrasyon ay papatayin din ang selula;at sa pangkalahatan, inaasahan namin na ang mas natutunaw na protina na ipinahayag sa cell, mas mabuti, ngunit sa maraming mga kaso kapag ang konsentrasyon ng IPTG ay masyadong mataas, isang malaking halaga ng pagsasama ang mabubuo.Katawan, ngunit ang halaga ng natutunaw na protina ay nabawasan.Samakatuwid, ang pinaka-angkop na konsentrasyon ng IPTG ay madalas na hindi mas malaki ang mas mahusay, ngunit mas mababa ang konsentrasyon.
Ang layunin ng induction at paglilinang ng genetically engineered strains ay upang mapataas ang ani ng target na protina at mabawasan ang mga gastos.Ang pagpapahayag ng target na gene ay hindi lamang apektado ng sariling mga salik ng strain at ang expression ng plasmid, kundi pati na rin ng iba pang mga panlabas na kondisyon, tulad ng konsentrasyon ng inducer, temperatura ng induction at oras ng induction.Samakatuwid, sa pangkalahatan, bago ang isang hindi kilalang protina ay ipinahayag at nalinis, pinakamahusay na pag-aralan ang oras ng induction, temperatura at konsentrasyon ng IPTG upang mapili ang naaangkop na mga kondisyon at makuha ang pinakamahusay na mga resulta ng eksperimentong.